轉(zhuǎn)自羅氏診斷生命科學(xué)公眾號

接頭連接是二代測序文庫制備的重要環(huán)節(jié)，接頭連接效率是影響文庫質(zhì)量和產(chǎn)量的重要指標之一，它直接影響文庫的多樣性以及低頻突變檢測的準確性。隨著測序儀的不斷迭代，接頭設(shè)計也在不斷升級，種類更加多樣化。

接頭結(jié)構(gòu)

接頭作為文庫的組成部分，以illumina接頭為例，一般包括P5/P7、Index以及R1 SP/R2 SP序列，長約60bp左右（不同種類的接頭長度有所不同）。其中P5/P7序列與測序芯片上的P5/P7序列互補，通過錨定將待測片段固定在flow cells上進行橋式PCR擴增；Index又稱為樣本標簽，目的是給文庫加上特定的標簽，用于文庫混合測序時區(qū)分不同的文庫樣本；R1 SP/R2 SP是Read1和Read2測序引物結(jié)合的區(qū)域，在dNTP和DNA聚合酶的作用下進行堿基延伸。下圖是接頭的一般結(jié)構(gòu)，呈“Y"字型。

接頭種類

羅氏測序樣本制備解決方案提供兼容illumina儀器的全套KAPA接頭產(chǎn)品組合(圖2)，按照接頭連接方式分為全長接頭和截短接頭。

全長接頭

KAPA UDI Adapters：是一種由P5/P7、96種雙端Index以及R1 SP/R2 SP序列組成的全長接頭，適用于PCR-free文庫制備流程。

截短接頭

截短接頭僅包括R1 SP/R2 SP序列，P5/P7和Index序列需通過引物擴增連入接頭。KAPA HyperPlex Adapters是一套完整的接頭組合產(chǎn)品：

KAPA Universal Adapter：截短型雙端通用接頭，適用于非低頻突變檢測

KAPA Universal UMI Adapter：帶有UMI（Unique Molecular Identifiers）的截短型雙端通用接頭，適用于低頻突變檢測

KAPA UDI Primer Mixes 1-384：搭配兩種KAPA通用短接頭使用，實現(xiàn)達384種Index組合的高通量混樣測序

接頭攻略

雙端標簽設(shè)計，有效剔除標簽

錯配序列

多重混樣測序時，有時會發(fā)生接頭標簽序列錯配的問題，進而導(dǎo)致測序數(shù)據(jù)質(zhì)量的下降和結(jié)果可信度的降低。錯配的風險主要由以下原因引發(fā)：

1）測序儀工作時發(fā)生的標簽跳躍/轉(zhuǎn)換現(xiàn)象

2）標簽試劑或者樣品間的交叉污染

3）混合樣品在PCR擴增時發(fā)生模板調(diào)換

4）測序或數(shù)據(jù)分析錯誤

KAPA UDI接頭雙端標簽組合在數(shù)據(jù)分析之前即可過濾掉因標簽錯配而產(chǎn)生的錯誤序列，從而提升變異識別準確性。

UMI標簽設(shè)計，提高低頻突變檢測準確性

低頻突變檢測在腫瘤研究，特別是液體活檢研究方面至關(guān)重要，但在文庫構(gòu)建、靶向富集和測序過程中引入的突變會阻礙低頻變異檢測的準確性，UMI標簽可以對原始樣本進行分子標記，有利于后續(xù)在數(shù)據(jù)分析時對原始樣本進行追蹤和分組，從而對假陽性突變進行校正。

KAPA Universal UMI Adapter采用羅氏專有設(shè)計，可防止因UMI序列發(fā)生錯誤導(dǎo)致樣本追蹤錯誤，在性能上表現(xiàn)出更高的雙鏈回收率和更低的錯誤率。

截短型KAPA HyperPlex接頭可以獲得

更高的文庫產(chǎn)量

KAPA HyperPlex接頭擴增效率高，文庫轉(zhuǎn)化率高，可以在較少的擴增循環(huán)數(shù)下得到較高的文庫產(chǎn)量，其文庫產(chǎn)量幾乎是全長接頭的兩倍。

滿足實驗所需文庫產(chǎn)量的情況下，較少的擴增循環(huán)可以增加文庫多樣性并減少PCR重復(fù)序列。

高質(zhì)量二代測序數(shù)據(jù)少不了接頭助力，

接頭怎么選你學(xué)會了嗎？

MC-CN-02167 有效期至2025年5月18日。